新开发的CRISPR系统使用结合Cas9靶序列的单链DNA(ssDNA)HDR模板(HDRT)，相对于dsDNA实现了两到三倍的敲入效率和产量。此外，这种不依赖病毒载体的方法允许科学家将特别长的DNA序列引入细胞基因组的精确位置。

“多年来，我们的目标之一就是以一种不依赖病毒载体的方式将冗长的DNA指令放入基因组的目标位点，”Gladstone-UCSF研究所所长、医学博士、哲学博士AlexMarson说。基因组免疫学。“这是朝着下一代安全有效的细胞疗法迈出的一大步。”

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Marson和他的同事们不仅描述了这项技术，还展示了如何使用它来生成CAR-T细胞，这些细胞有可能对抗多发性骨髓瘤(一种血癌)，以及重写可能导致罕见遗传性免疫疾病的突变的基因序列.

“我们表明，我们可以在单次运行中设计超过10亿个细胞，这远远超过了我们治疗单个患者所需的细胞数量，”Marson实验室的临床研究员BrianShy医学博士说。

“使用病毒载体既昂贵又耗费资源，”Shy说。“基因工程非病毒方法的一个主要好处是我们不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。”

使用高浓度双链DNA(dsDNA)和Cas9靶序列来提高CRISPR介导的插入效率可能对原代细胞有毒。单链DNA对细胞的毒性较小，即使在相对较高的浓度下也是如此。在新方法中，研究人员描述了一种将修饰的Cas9酶连接到单链模板DNA的方法，方法是在末端仅添加一小部分双链DNA。

“这为我们提供了一种平衡的、两全其美的方法，”Marson说。

与旧的双链方法相比，单链模板DNA可以使基因编辑的效率提高一倍以上。分子的双链末端让研究人员可以使用Cas9来增强非病毒载体向细胞的递送。

“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、成本更低，”医学博士、加州大学旧金山分校实验室医学助理教授兼Gladstone附属研究员JonathanEsensten说。

在这项研究中，研究人员使用新的DNA模板生成了超过10亿个靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞。大约一半的T细胞获得了新基因，并因此转化为CAR-T细胞。

“我们知道将DNA模板定位到基因组中的特定位置，称为TRAC位点，将提高CAR-T细胞的抗肿瘤效力，”血液学部医学助理教授JustinEyquem博士说。和加州大学旧金山分校的肿瘤学，以及格拉德斯通的附属研究员。“这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现目标，这将加速下一代CAR-T细胞疗法的开发。”

此外，研究人员表明，他们的方法首次可以完全替代与罕见遗传性免疫疾病相关的两个基因，即IL2RA和CTLA4基因。

过去，科学家们已经证明他们可以替换特定患者发生突变的IL2RA基因的一小部分。现在，Marson的团队证明他们可以同时替换整个IL2RA和CTLA4基因——一种“一刀切”的方法，可以治疗许多在这些基因中具有不同突变的患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。用这种基因工程方法处理的细胞中有将近90%获得了基因的健康版本。

研究人员现在正在寻求批准，以推进在CAR-T细胞疗法和IL2RA缺陷治疗中使用非病毒CRISPR技术的临床试验。